強(qiáng)直性脊柱炎（AS）是一種全身性炎癥性疾病，據(jù)報(bào)道中國(guó)人群的患病率為0.29%。強(qiáng)直性脊柱炎可能造成不可逆的骨骼結(jié)構(gòu)損傷和殘疾，導(dǎo)致疲勞、睡眠障礙、精神疾病等，最終致使患者生活質(zhì)量下降，并給醫(yī)療保健系統(tǒng)和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)度指數(shù)（BASDAI）是衡量強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)的常用指標(biāo)，但由于其主觀性和患者驅(qū)動(dòng)的性質(zhì)，存在一定局限性。現(xiàn)階段關(guān)于強(qiáng)直性脊柱炎潛在生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究仍然有限，該領(lǐng)域的進(jìn)一步探索對(duì)于了解強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病機(jī)制以及確定新的診斷和治療策略至關(guān)重要。
2025年5月，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院劉宏瀟團(tuán)隊(duì)與國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心馬潔團(tuán)隊(duì)在Journal of Advanced Research（IF=11.4）期刊上發(fā)表題為“Characterization of immune features and discovery of potential biomarkers for ankylosing spondylitis using deep plasma proteomics”的最新研究成果，利用深度血漿蛋白質(zhì)組學(xué)描述免疫特征并發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎的潛在生物標(biāo)志物。
北京青蓮百奧生物科技有限公司為該研究提供基于MagicOmics DMB低豐度蛋白富集磁珠試劑盒的深度血漿蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)服務(wù)。
研究首先對(duì)發(fā)現(xiàn)隊(duì)列（n=104，包括活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者，n=48；穩(wěn)定期強(qiáng)直性脊柱炎患者，n =21；健康對(duì)照者，n=35）進(jìn)行血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析，根據(jù)血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)研究強(qiáng)直性脊柱炎的免疫特征和功能障礙；之后通過(guò)結(jié)合隨機(jī)森林算法（RF）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型驅(qū)動(dòng)的評(píng)分矩陣，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1可作為強(qiáng)直性脊柱炎的潛在生物標(biāo)志物；最后，在驗(yàn)證隊(duì)列（n=79，包括活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者，n=27；穩(wěn)定期強(qiáng)直性脊柱炎患者，n=28；健康對(duì)照者，n=24）中通過(guò)ELISA實(shí)現(xiàn)驗(yàn)證。
圖1 強(qiáng)直性脊柱炎深度血漿蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析工作流程
值得一提的是，本研究的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析使用青蓮百奧自研MagicOmics DMB低豐度蛋白富集磁珠試劑盒實(shí)現(xiàn)前處理，采用數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，最終共鑒定到3891種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)豐度分布達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)，體現(xiàn)了血漿蛋白質(zhì)組的深度覆蓋。
強(qiáng)直性脊柱炎是一種與免疫性疾病密切相關(guān)的疾病，多種免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)對(duì)其發(fā)病機(jī)制有顯著影響；本研究根據(jù)血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)通過(guò)CIBERSORT方法計(jì)算免疫細(xì)胞類型和比例，進(jìn)而描述強(qiáng)直性脊柱炎患者的免疫學(xué)特征。
結(jié)果表明，記憶B淋巴細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、靜息記憶CD4+ T細(xì)胞和初始CD4+ T細(xì)胞的比例在三組之間存在顯著差異。與健康對(duì)照者相比，在活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者中觀察到靜息記憶CD4+ T細(xì)胞數(shù)量顯著增加；在穩(wěn)定期強(qiáng)直性脊柱炎患者中觀察到M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，表明其在強(qiáng)直性脊柱炎穩(wěn)定中的潛在作用。
圖2 基于血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的強(qiáng)直性脊柱炎免疫特征
與健康對(duì)照者相比，在活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者中確定了376個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)（DEP）。分析表明，203個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)主要參與凝血、肌動(dòng)蛋白絲組織、傷口愈合以及白細(xì)胞遷移等功能，173個(gè)下調(diào)蛋白質(zhì)主要參與代謝過(guò)程、RNA加工、運(yùn)輸和定位以及翻譯等功能。
圖3 活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者和健康對(duì)照者的蛋白質(zhì)組學(xué)特征和功能分析
對(duì)這376個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行k-means聚類表達(dá)趨勢(shì)分析，在健康對(duì)照者、活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者、穩(wěn)定期強(qiáng)直性脊柱炎患者三組中揭示了四簇不同的聚類。其中：
簇1包含在活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者中相比健康對(duì)照表達(dá)下調(diào)，但在穩(wěn)定期強(qiáng)直性脊柱炎患者中恢復(fù)的蛋白質(zhì)，主要富集于胰高血糖素信號(hào)通路、丙酮酸代謝和糖異生，這部分蛋白質(zhì)的相關(guān)功能在活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者中可能喪失；
簇4包含在活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者中相比健康對(duì)照表達(dá)上調(diào)，但在穩(wěn)定期強(qiáng)直性脊柱炎患者中恢復(fù)的蛋白質(zhì)，主要富集于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、黏著斑和趨化因子信號(hào)通路，這部分功能蛋白質(zhì)的失調(diào)可能與強(qiáng)直性脊柱炎的病理進(jìn)程相關(guān)；
簇2/簇3代表在活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者中表達(dá)下調(diào)/上調(diào)，但在穩(wěn)定期強(qiáng)直性脊柱炎患者中未能恢復(fù)到健康對(duì)照水平的蛋白質(zhì)，主要富集于剪接體和核糖體通路/血小板活化、緊密連接等方面。
圖4 強(qiáng)直性脊柱炎不同階段的蛋白質(zhì)組學(xué)特征
基于376個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)構(gòu)建了隨機(jī)森林算法（RF）機(jī)器學(xué)習(xí)模型，用于區(qū)分強(qiáng)直性脊柱炎患者與健康對(duì)照者。模型以隊(duì)列70%的樣本為訓(xùn)練集，30%的樣本為獨(dú)立測(cè)試集，執(zhí)行五折交叉驗(yàn)證?；煜仃囷@示，模型具有高精準(zhǔn)度和理想召回率，強(qiáng)直性脊柱炎患者100%被準(zhǔn)確預(yù)測(cè)為陽(yáng)性病例，健康對(duì)照者91%被準(zhǔn)確預(yù)測(cè)為陰性病例。模型的受試者工作特征（ROC）與精確率-召回率（PR）曲線下面積（AUC）分別達(dá)0.926與0.918，表明其能精準(zhǔn)區(qū)分陽(yáng)性與陰性病例，并以出色的準(zhǔn)確性預(yù)測(cè)陽(yáng)性結(jié)果。
圖5 構(gòu)建基于隨機(jī)森林算法的模型區(qū)分強(qiáng)直性脊柱炎患者與健康對(duì)照者
首先，對(duì)基于隨機(jī)森林算法的模型的分類準(zhǔn)確率與基尼重要性進(jìn)行排名，并將其映射到[0,5]的分值區(qū)間；之后，使用正交偏最小二乘判別分析，計(jì)算每個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)在區(qū)分活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者與健康對(duì)照者時(shí)的變量投影重要性（VIP）得分，并將VIP值排序并映射到[0,5]的分值區(qū)間，根據(jù)不同的閾值標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其相應(yīng)的校正后p-value進(jìn)行劃分并予以0-5的賦分；此外，將log2|FC|（以2為底的差異倍數(shù)絕對(duì)值的對(duì)數(shù)）排序并映射到0-5的分值區(qū)間，同樣根據(jù)不同的閾值標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其相應(yīng)的校正后p-value進(jìn)行劃分并予以0-5的賦分；最終，整合上述所有評(píng)分參數(shù)構(gòu)建生物標(biāo)志物的評(píng)分矩陣，該矩陣中的平均得分指示每個(gè)蛋白質(zhì)在區(qū)分強(qiáng)直性脊柱炎患者與健康對(duì)照者時(shí)的重要性。
圖6 使用基于機(jī)器學(xué)習(xí)的評(píng)分矩陣識(shí)別強(qiáng)直性脊柱炎的潛在生物標(biāo)志物
結(jié)合評(píng)分矩陣、功能分析和強(qiáng)直性脊柱炎不同階段蛋白質(zhì)表達(dá)趨勢(shì)，確定蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1作為強(qiáng)直性脊柱炎候選生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1在活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者中的表達(dá)水平均升高，在穩(wěn)定期強(qiáng)直性脊柱炎患者中恢復(fù)正常水平，表明其可用作強(qiáng)直性脊柱炎的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。SAA1、FERMT3、ILK、TLN1預(yù)測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎患者區(qū)分于健康對(duì)照者的判別效率分別為0.745、0.880、0.815、0.851；預(yù)測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎從活動(dòng)期到穩(wěn)定期的判別效率為0.719、0.813、0.850、0.851，普遍高于ESR（紅細(xì)胞沉降率，客觀炎癥標(biāo)志物）的判別效率，與CRP（C-反應(yīng)蛋白，客觀炎癥標(biāo)志物）相當(dāng)或與之相比略高。
對(duì)驗(yàn)證隊(duì)列（n=79，包括活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者，n=27；穩(wěn)定期強(qiáng)直性脊柱炎患者，n=28；健康對(duì)照者，n=24）的血漿樣本進(jìn)行ELISA驗(yàn)證。觀察到蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1在三組間的表達(dá)趨勢(shì)與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果一致。利用這四種蛋白質(zhì)構(gòu)建組合模型，進(jìn)一步使用ELISA數(shù)據(jù)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，該模型能有效區(qū)分活動(dòng)期強(qiáng)直性脊柱炎患者與健康對(duì)照者。這體現(xiàn)了通過(guò)基于血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的評(píng)分矩陣篩選出的強(qiáng)直性脊柱炎生物標(biāo)志物具備作為潛在藥物靶點(diǎn)以及疾病判別候選標(biāo)志物的潛力。
本研究提出了一種新策略，通過(guò)將蛋白質(zhì)組學(xué)分析與基于機(jī)器學(xué)習(xí)的方法相結(jié)合，闡明強(qiáng)直性脊柱炎的病理機(jī)制并發(fā)現(xiàn)了生物標(biāo)志物，并探索潛在治療靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)不同階段的強(qiáng)直性脊柱炎患者進(jìn)行深度血漿蛋白質(zhì)組分析，觀察到幾種蛋白表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化，這些蛋白質(zhì)體現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎的進(jìn)展，并與其病理機(jī)制相關(guān)。最終，通過(guò)ELISA驗(yàn)證蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1可作為強(qiáng)直性脊柱炎的潛在生物標(biāo)志物。其中，F(xiàn)ERMT3、ILK、TLN1參與整合素通路，該通路對(duì)細(xì)胞粘附和遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用至關(guān)重要，表明其可能與在強(qiáng)直性脊柱炎中觀察到的炎癥反應(yīng)有關(guān)。整合素通路中的相關(guān)分子可能作為強(qiáng)直性脊柱炎的潛在治療靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步研究。
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