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NC項目文章 | 中國人民解放軍總醫(yī)院何昆侖教授團隊揭示藏族人高海拔適應(yīng)新機制

藏族人對高海拔的適應(yīng)是研究現(xiàn)代人類進化史上適應(yīng)的理想模型，因為其環(huán)境控制的很好。在高海拔地區(qū)，高原反應(yīng)（包括急性高山病、肺水腫和腦水腫等）較為常見，但藏族人群的患病率低于漢族人群，以往的研究主要集中在缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）途徑上。然而，這種適應(yīng)性在種群規(guī)模上仍然不足。結(jié)構(gòu)變異（SVs）在基因組生物學(xué)功能和人類進化適應(yīng)中扮演重要角色，可以影響遠程基因調(diào)控、基因簇擴增和強效適應(yīng)性變化。然而，但人類基因中SV熱點的分布模式仍不完全清楚。

2023年12月，中國人民解放軍總醫(yī)院何昆侖教授團隊在期刊Nature Communications（IF=16.6）發(fā)表題為《Structural variants involved in high-altitude adaptation detected using single-molecule long-read sequencing》的研究論文，該研究構(gòu)建了一個大規(guī)模的漢族和藏族人口的SV景觀，揭示了SVs藏族人對高海拔適應(yīng)的潛在作用。通過增強子報告基因，細胞敲除，DNA pull-down實驗，研究發(fā)現(xiàn)藏族基因特性的缺失破壞了超級增強子，并下調(diào)了EPAS1的表達，揭示了基因調(diào)控回路重組在人類適應(yīng)中的作用。青蓮百奧為該研究提供了DNA pull-down質(zhì)譜檢測分析服務(wù)。

文章題目：Structural variants involved in high-altitude adaptation detected using single-molecule long-read sequencing

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：16.6

發(fā)表時間：2023年12月13日

發(fā)表單位：中國人民解放軍總醫(yī)院

研究策略

樣本選擇：320例人血液（201例漢族和119例藏族）用于ONT長讀長測序；150例人血液（75例漢族和75例藏族，其中123例既測長讀長又測短讀長）用于短讀長測序。
實驗技術(shù)：單分子長讀長測序，短讀長測序，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除，RT-qPCR，DNA pull-down

研究結(jié)果

一、構(gòu)建和驗證漢族和藏族SVs調(diào)用集

這項研究使用了ONT（Oxford Nanopore Technologies）的PromethION平臺對201個漢族和119個藏族個體的基因組進行了長讀長測序，平均覆蓋深度為20.24。每個樣本通過cuteSV，sniffles和nanovar調(diào)用的SVs，并使用dbSVmerge將320個SV調(diào)用合并成最終的漢族和藏族SV調(diào)用集。在漢族人群中檢測到了116,773個SVs，在藏族人群中檢測到了94,312個SVs，總共檢測到了136,257個SVs。這些SVs主要包括71,437個刪除、56,799個插入、7198個復(fù)制和823個反轉(zhuǎn)，平均每個樣本包含19,272個SVs（圖1b）。在50%的樣本中，漢族和藏族種群中超過90%的SVs被捕獲，表明，樣本量足以描述漢族和藏族人群的SV景觀。

通過手動驗證、PCR驗證和與其他平臺（如PacBio、HiFi）的結(jié)果進行比較，來驗證SV調(diào)用集的質(zhì)量，結(jié)果顯示，他們的SV調(diào)用集具有高質(zhì)量。結(jié)果還顯示，長讀長測序平臺在處理具有GC偏向性的基因組區(qū)域時也表現(xiàn)良好。與NGS相比，ONT平臺在GC含量較高的區(qū)域中檢測到了更多的SVs。最后，將SV調(diào)用集與其他公共SV集進行了比較，發(fā)現(xiàn)該研究擴展了東亞人群的SV調(diào)用集，增加了約43%的新SVs。此外，該研究還貢獻了42,261個新的全局SVs，其中包括11,137個藏族特有的SVs和20,571個漢族特有的SVs。

總的來說，這項研究為漢族和藏族人群提供了高質(zhì)量的SV調(diào)用集。

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圖1：119例藏族樣本和201例漢族樣本中SV的發(fā)現(xiàn)

二、SV的全基因組特性

SVs主要分布在重復(fù)區(qū)域（約67%在重復(fù)區(qū)域），如轉(zhuǎn)座子和衛(wèi)星重復(fù)區(qū)域。這可能是因為重復(fù)區(qū)域更容易發(fā)生非等位同源重組、復(fù)制滑脫和非同源末端連接等過程，導(dǎo)致SVs的產(chǎn)生。在各類重復(fù)元素中，SVs在SINEs、LINEs和LTRs中的分布比例分別為15%、8%和4%，而在衛(wèi)星重復(fù)區(qū)域和簡單重復(fù)中的比例分別為4%和21%（圖2a）。不同類型的SVs在各類重復(fù)和功能元素中的分布存在偏差。例如，刪除、插入和復(fù)制與SINEs和簡單重復(fù)相關(guān)，而反轉(zhuǎn)則與LINEs、SINEs、簡單重復(fù)和LTRs相關(guān)。此外，SV的長度分布顯示了兩個明顯的峰值，分別位于約300bp（Alu）和約6kb（LINE）。SVs在基因組中的熱點區(qū)域也被揭示，這些熱點區(qū)域是SVs密度極高的區(qū)域，與其他區(qū)域相比，它們更容易發(fā)生SVs。例如，C7orf50區(qū)域就與大量的SVs相關(guān)，表明這個區(qū)域容易發(fā)生DNA斷裂和SVs的形成。SVs與基因表達的調(diào)控密切相關(guān)。由于啟動子和增強子與SINEs相關(guān)，因此它們也與SINE相關(guān)的SVs相關(guān)。此外，刪除、復(fù)制、插入和SINE相關(guān)的SVs在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄方面比其他類型的SVs更為重要。

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圖2 SV組成、長度頻率和染色質(zhì)分布

三、漢族-藏族群體遺傳和功能性SV在進化適應(yīng)中的作用

結(jié)構(gòu)變異是一種基因組的變異形式，可以作為區(qū)分不同人群的一個重要特征。研究發(fā)現(xiàn)，漢族和藏族共同擁有74,828個SVs。通過主成分分析（PCA），漢族和藏族的SVs可以明顯區(qū)分。當將PCA擴展到1KGP數(shù)據(jù)庫中的其他人群（如非洲、美洲、東亞、歐洲和南亞人群）時，發(fā)現(xiàn)漢族和藏族與東亞人群關(guān)系密切，而與其他人群距離較遠。這表明藏族在遺傳上與漢族更接近，與其他人群相比，這兩個人群可能來源于一個共同的祖先（圖3a）。此外，通過混合分析和所有SVs的進化樹分析，發(fā)現(xiàn)漢族和藏族在SVs上存在明顯的分離（圖3b）。層次聚類分析也顯示，漢族和藏族具有民族特異的SVs和共同的SVs。基于也清楚地顯示了漢族和藏族之間的分離（圖3c）。

這些結(jié)果表明，除了單核苷酸多態(tài)性（SNPs）外，SVs也是區(qū)分遺傳上密切相關(guān)人群的一個穩(wěn)健的代表性特征。

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圖3 漢族和藏族群體遺傳學(xué)

本文研究了藏族人適應(yīng)高海拔環(huán)境的基因組信號，藏族人適應(yīng)高海拔環(huán)境的基因組信號是由SNPs、InDels和SVs協(xié)同作用所實現(xiàn)的。通過深度短讀長測序和長讀長測序數(shù)據(jù)的綜合分析，在EGLN1和EPAS1等基因區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了明顯的進化選擇信號。在藏漢人群的差異研究中，篩選了FST>0.1的SVs，發(fā)現(xiàn)了240個SVs，其中19個是新穎的，169個在藏族人中的頻率高于漢族人（圖4b）。這些SVs可能與高海拔適應(yīng)性相關(guān)，特別是EGLN1基因中的一個插入物與先前報道的高海拔相關(guān)性一致。SVs可以通過改變順式調(diào)控電路來實現(xiàn)廣泛的遠端調(diào)控，作者發(fā)現(xiàn)52%的SVs與增強子、沉默子或拓撲關(guān)聯(lián)域（TAD）邊界重疊，進一步表明了SVs在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要性。

深入研究了17個FST>0.2的SVs，包括3個新穎的SVs，這些SVs附近的蛋白編碼基因與缺氧反應(yīng)、炎癥、葡萄糖、脂質(zhì)和能量代謝、胰島素受體信號傳導(dǎo)、血液凝固和角蛋白絲等生物學(xué)特性有關(guān)。特別是dbsv66240 SV破壞了一個超級增強子，下調(diào)了EPAS1的表達，這是藏族人中最強的特異性信號，表明SVs在高海拔適應(yīng)性中的重要作用。這些結(jié)果表明，這個SV與這些SNPs和InDels協(xié)同作用，影響高海拔適應(yīng)性。此外，EPAS1和TMEM247在藏獒中也受到正向選擇，并顯示出不同的關(guān)聯(lián)信號，表明它們都對適應(yīng)性有功能貢獻。

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圖4 漢族、藏族種群比較揭示進化適應(yīng)的遺傳景觀

研究了藏族人群體中的兩個特定結(jié)構(gòu)變異（SVs）：dbsv66240的刪除和dbsv124029的插入，以及它們對生物學(xué)功能和適應(yīng)性的影響。研究發(fā)現(xiàn)：dbsv6620刪除涉及基因調(diào)控增強子和啟動子，可能在腎臟細胞中發(fā)揮順式調(diào)控作用，影響缺氧反應(yīng)相關(guān)基因的表達，如EPAS1。該刪除還通過反式調(diào)控電路影響基因轉(zhuǎn)錄活性，改變了與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基因組區(qū)域，從而可能下調(diào)基因表達。通過DNA pull-down實驗，發(fā)現(xiàn)202個結(jié)合蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子、中介復(fù)合物和鋅指蛋白。GO分析顯示，與dbsv66240序列結(jié)合的蛋白質(zhì)主要富集在與轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏活性等分子功能相關(guān)的類別中。另一方面，dbsv124029插入與藏族人的長壽、睡眠質(zhì)量和情緒有關(guān)，位于C7of50和ZFAND2A之間，且位于與失眠癥狀和舒張壓相關(guān)的遺傳區(qū)域內(nèi)，并可能通過復(fù)雜的順式和反式調(diào)控電路影響相關(guān)基因的表達。這些發(fā)現(xiàn)表明，藏族人中最具特色的SVs通過重塑與高原適應(yīng)相關(guān)的基因表達，對適應(yīng)性表型差異有所貢獻。研究還發(fā)現(xiàn)了與藏族人頭痛發(fā)生率、脂質(zhì)代謝、跟骨密度和出生體重相關(guān)的基因變異。例如，位于TIMD4基因內(nèi)含子中的一個變異可能會影響TIMD4的表達，從而影響頭痛發(fā)生率，同時也與甘油三酯、低密度脂蛋白（LDL）膽固醇和總膽固醇水平有關(guān)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了一些功能不明的基因變異，這些變異可能與學(xué)習(xí)、發(fā)聲行為、突觸前組裝和自閉癥等相關(guān)。

這些發(fā)現(xiàn)揭示了藏族人通過基因變異來適應(yīng)高海拔地區(qū)的環(huán)境壓力，增進了對人類適應(yīng)性進化的理解，也提供了新的視角來研究其他復(fù)雜的人類性狀和疾病。

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