2025年4月16日，德國(guó)馬普所Matthias Mann團(tuán)隊(duì)聯(lián)合多國(guó)研究者在《Nature》發(fā)表題為"Deep Visual Proteomics maps proteotoxicity in a genetic liver disease"的突破性研究！研究通過(guò)團(tuán)隊(duì)自主開(kāi)發(fā)的深度視覺(jué)蛋白質(zhì)組技術(shù)（DVP），首次在α1-抗胰蛋白酶缺乏癥（AATD）患者肝組織中繪制了單細(xì)胞分辨率下蛋白質(zhì)毒性反應(yīng)的空間蛋白圖譜，為理解遺傳性肝病進(jìn)展機(jī)制提供了全新視角。
AATD是由SERPINA1基因突變引起的遺傳病，全球每2000人中即有1例。突變導(dǎo)致α1-抗胰蛋白酶（AAT）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常聚集，引發(fā)肝細(xì)胞應(yīng)激和纖維化。盡管已知AAT積累是致病核心，但：
肝細(xì)胞如何逐步響應(yīng)蛋白質(zhì)毒性壓力？
不同纖維化階段的分子異質(zhì)性是什么？
細(xì)胞間應(yīng)激信號(hào)傳遞機(jī)制有哪些？
這三個(gè)問(wèn)題仍然是未解之謎，而傳統(tǒng)模型系統(tǒng)（如小鼠或iPSC）難以復(fù)現(xiàn)人類(lèi)組織中的復(fù)雜微環(huán)境，所以需要對(duì)人類(lèi)組織進(jìn)行高分辨率空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析以解答以上問(wèn)題。
利用基于FFPE臨床樣本的高分辨率空間蛋白質(zhì)組學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)：
單細(xì)胞水平空間層面解析AAT積累的蛋白分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)
追蹤不同纖維化階段的應(yīng)激響應(yīng)空間特征
揭示細(xì)胞自主性與微環(huán)境互作機(jī)制及空間分布
發(fā)現(xiàn)AATD的潛在治療靶點(diǎn)
AAT積累觸發(fā)動(dòng)態(tài)的蛋白表達(dá)響應(yīng)程序，可能存在早期潛在標(biāo)志物，且晚期纖維化樣本呈現(xiàn)獨(dú)特的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)崩潰特征，細(xì)胞間存在應(yīng)激信號(hào)傳遞的形態(tài)學(xué)證據(jù)。
納入34例Pi*ZZ純合患者（丹麥16例+德國(guó)18例）的FFPE樣本
活檢樣本：F1-F3纖維化階段（n=21）
移植肝樣本：終末期F4（n=5）
技術(shù)重復(fù)樣本（n=8）
所有樣本經(jīng)病理確認(rèn)（天狼星紅/三色染色），配套臨床數(shù)據(jù)包括年齡（58±10歲）、BMI（25.2±4.0）、飲酒史等。
深度視覺(jué)蛋白質(zhì)組學(xué)（Deep Visual Proteomics, DVP）是Mann團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的一種融合人工智能、空間生物學(xué)與超靈敏質(zhì)譜的空間蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)體系。有以下特點(diǎn)：
AI驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞形態(tài)分類(lèi)（ConvNeXt神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)）
根據(jù)智能形態(tài)區(qū)域劃分進(jìn)行激光顯微切割
超高靈敏度質(zhì)譜（Orbitrap Astral）
本文利用其團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的DVP技術(shù)實(shí)現(xiàn)從單個(gè)組織切割塊（大約10~15 cells）中檢測(cè)到高達(dá)4300種蛋白質(zhì)，并通過(guò)2048個(gè)圖像特征進(jìn)行形態(tài)-蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析，最后構(gòu)建纖維化階段特異性蛋白網(wǎng)絡(luò)。具體研究結(jié)果如下所述。
為了解析AATD中蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激的分子機(jī)制及纖維化階段的動(dòng)態(tài)變化，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)34例AATD患者（Pi*ZZ基因型）的FFPE肝活檢組織（涵蓋纖維化階段F1-F4）進(jìn)行Deep Visual Proteomics（DVP）高分辨率空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過(guò)激光顯微切割分離單個(gè)肝臟組織塊（體積相當(dāng)于10-15個(gè)細(xì)胞），利用高靈敏度Orbitrap Astral質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高AAT積累細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體（peroxisome）顯著上調(diào)（23倍差異），早于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的經(jīng)典通路。AAT積累具有細(xì)胞內(nèi)在性，相鄰細(xì)胞間應(yīng)激傳遞有限，提示病理進(jìn)程主要由細(xì)胞自主機(jī)制驅(qū)動(dòng)。
圖1. DVP流程與顯微切割示意圖
隨后研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)AAT積累水平將細(xì)胞分為低、中、高三類(lèi)，結(jié)合單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和通路富集分析，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體生物發(fā)生因子（如PEX11B）和抗氧化蛋白（硫氧還蛋白）優(yōu)先上調(diào)（早期響應(yīng)），伴隨脂代謝重編程。UPR核心通路（ATF6、PERK、IRE1）激活延遲（晚期響應(yīng)），線粒體復(fù)合體I活性降低。過(guò)氧化物酶體反應(yīng)在晚期纖維化（F4）中啟動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，提示其作為潛在干預(yù)窗口。
圖3.單細(xì)胞水平繪制完整組織空間蛋白表達(dá)圖譜
在這個(gè)AI發(fā)展正旺的時(shí)代，生物學(xué)實(shí)驗(yàn)也在逐步響應(yīng)發(fā)展的號(hào)召。作者利用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN, ConvNeXt）對(duì)肝切除樣本中的AAT聚集體進(jìn)行形態(tài)分型，結(jié)合激光顯微切割和質(zhì)譜分析12,500個(gè)細(xì)胞，用CNN將肝細(xì)胞分為“球形聚集體”“無(wú)定形聚集體”和正常細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與凋亡誘導(dǎo)因子TNFSF10（TRAIL）和炎癥標(biāo)志物CRP顯著相關(guān)，伴隨UPR核心蛋白（如ERO1A）下調(diào)，且以未折疊蛋白響應(yīng)通路激活為主，提示球形聚集體代表晚期死亡表型。此外，還發(fā)現(xiàn)了新的潛在標(biāo)志物，EGFL7（表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白7）在球形聚集體中特異性高表達(dá)，與肝癌預(yù)后不良相關(guān)。
圖4. 結(jié)合人工智能圖像分析的DVP技術(shù)解析AAT聚集形態(tài)特征
前面部分中作者發(fā)現(xiàn)了低纖維化階段（F1）過(guò)氧化物酶體活性顯著增強(qiáng)，所以推測(cè)PPAR-α激動(dòng)劑（如貝特類(lèi)藥物）可能通過(guò)促進(jìn)過(guò)氧化物酶體生物合成改善晚期肝纖維化，因其安全性已獲驗(yàn)證，可快速進(jìn)入臨床使用。
本研究通過(guò)空間深度視覺(jué)蛋白質(zhì)組學(xué)（DVP）技術(shù)，首次在單細(xì)胞分辨率下揭示了AATD患者肝組織中蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激的空間蛋白異質(zhì)性。結(jié)合激光顯微切割與人工智能圖像分析，精準(zhǔn)定位到AAT高負(fù)荷細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體在AAT聚集早期即顯著上調(diào)，且其激活具有空間特異性，早于傳統(tǒng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。結(jié)合AI形態(tài)學(xué)分型發(fā)現(xiàn)球形AAT聚集體與凋亡標(biāo)志物TNFSF10密切相關(guān)，提示EGFL7可作為終末死亡表型的生物標(biāo)志物，同時(shí)指出低纖維化階段過(guò)氧化物酶體活性增強(qiáng)或?yàn)楦深A(yù)新靶點(diǎn)，為靶向蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。
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